質(zhì)粒電轉(zhuǎn)整合穩(wěn)定細(xì)胞株
▏ 名詞定義
電穿孔，也稱為電通透化，是一種高效的非病毒遞送系統(tǒng)，可使遺傳物質(zhì)（DNA和RNA）、蛋白質(zhì)、藥物或其他分子進(jìn)入細(xì)胞。它利用精確的脈沖電流在細(xì)胞膜上制造臨時孔隙，使分子能夠通過。
一旦質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞，就可能作用于細(xì)胞。遺傳物質(zhì)可能保持獨(dú)立（以質(zhì)粒的形式，未整合），也可能根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)步驟整合到宿主基因組中。
▏ 工作原理
體外電穿孔時，將靶細(xì)胞懸浮液與待導(dǎo)入細(xì)胞的質(zhì)粒DNA在導(dǎo)電溶液中混合，然后放入比色皿中（圖1）。電穿孔比色皿的樣品室兩側(cè)各有一塊金屬板，電流可以通過混合物。將比色皿放入電穿孔儀的腔室中，該腔室配有相應(yīng)的電觸點(diǎn)，使比色皿形成電路。電穿孔儀上的控制器允許用戶設(shè)置待輸送電脈沖的電壓、波形和持續(xù)時間，這些參數(shù)應(yīng)根據(jù)靶細(xì)胞類型進(jìn)行優(yōu)化。然后，電脈沖通過樣品室。
圖 1：裝有比色皿的電穿孔儀主要部件示意圖。圖片來源：Richard Wheeler
電脈沖擾亂細(xì)胞膜的磷脂雙層，從而形成孔隙（圖 2）。這種過程是不對稱的，孔隙首先在細(xì)胞的陽極側(cè)形成。同時，跨膜電位增加。這驅(qū)使帶電分子（例如質(zhì)粒DNA）首先吸附到細(xì)胞陰極側(cè)的膜上，然后穿過這些孔隙進(jìn)入細(xì)胞 （圖 3）。
圖2：電穿孔過程中細(xì)胞膜破壞和孔隙形成的示意圖。圖片來源：Technology Networks。
▏ 優(yōu)缺點(diǎn)
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優(yōu)點(diǎn) |
缺點(diǎn) |
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操作相對簡單 |
需要專用儀器 |
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對轉(zhuǎn)染難度較大的細(xì)胞類型效果良好 |
參數(shù)必須經(jīng)過仔細(xì)優(yōu)化 |
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無載體要求，甚至不需要載體 |
對細(xì)胞損傷較大，部分無法恢復(fù)而死亡 |
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對細(xì)胞類型的依賴性小 |
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快遞轉(zhuǎn)染大量細(xì)胞，相對成本低 |
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可以轉(zhuǎn)染含有細(xì)胞壁的物種 |
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▏ 關(guān)鍵參數(shù)
制定電穿孔方案時，重要的是選擇合適的參數(shù)，使其能夠?qū)崿F(xiàn)通透性，同時最大程度地減少對細(xì)胞膜的干擾，以最大限度地提高細(xì)胞活力、實(shí)驗(yàn)可重復(fù)性和效率。需要考慮的因素包括：
1. 波形：指數(shù)衰減脈沖、方波脈沖
方波脈沖迅速上升到設(shè)定電壓，維持該水平，然后在脈沖結(jié)束時迅速截止；指數(shù)衰減波的電壓迅速上升到目標(biāo)值，然后隨時間下降。一般而言，哺乳動物轉(zhuǎn)染選擇方波脈沖比較多；
2. 脈沖時間：針對方波脈沖，一般是直接設(shè)置持續(xù)時間；指數(shù)衰減脈沖會隨著時間延長，電壓逐漸降低，一般用時間常數(shù)TC表示，需要結(jié)合對細(xì)胞的損傷來優(yōu)化；
3. 場強(qiáng)：指施加于電極間隙的電壓，這個電壓跟很多因素有關(guān)，比如比色皿的間隙、細(xì)胞的大小、溫度等。
4. 緩沖液：緩沖液的電阻、鹽濃度、緩存能力都會影響電轉(zhuǎn)效果，比如有些敏感細(xì)胞更喜歡培養(yǎng)基組份；
5. 溫度：高功率一般傾向于低溫，比如冰上操作；
6. pH變化：電極電解可能引起pH變化，可以通過緩沖液調(diào)整；
7. 細(xì)胞數(shù)量：細(xì)胞過密會導(dǎo)致電弧放電，過稀會降低陽性比率；
8. 細(xì)胞質(zhì)量：因?yàn)殡娹D(zhuǎn)本身對細(xì)胞有損傷，因此被電轉(zhuǎn)的細(xì)胞質(zhì)量尤為重要，一般是選擇健康、無污染、分裂活躍、代數(shù)低的細(xì)胞；
9. 質(zhì)粒質(zhì)量：質(zhì)量差或者污染的質(zhì)粒DNA會降低電轉(zhuǎn)效率；
其他：比色皿表面的水份、高鹽、氣泡等，都可以引起電弧放電。
▏ 瞬時表達(dá)和穩(wěn)定整合
▏ 應(yīng)用場景
1 瞬時轉(zhuǎn)染，追求瞬間高拷貝/超拷貝的蛋白表達(dá)； 2 穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建，生物安全等級低，對整和效率、整合位置要求不高。
▏ 穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)
科佰生物提供“質(zhì)粒電轉(zhuǎn)整合系統(tǒng)”穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建服務(wù)，利用該系統(tǒng)，我們已經(jīng)成功構(gòu)建超過300株穩(wěn)定細(xì)胞株的模型，有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，歡迎溝通咨詢。
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質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 |
病毒感染 |
Flp-FRT系統(tǒng) |
轉(zhuǎn)座子系統(tǒng) |
基因編輯 |
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脂質(zhì)體 |
電轉(zhuǎn) |
慢病毒 |
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適用細(xì)胞 |
部分細(xì)胞 |
幾乎所有細(xì)胞 |
幾乎所有細(xì)胞 |
內(nèi)部4種細(xì)胞 |
幾乎所有細(xì)胞 |
部分細(xì)胞 |
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轉(zhuǎn)染/感染效率 |
低 |
中 |
高 |
高 |
高 |
低 |
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隨機(jī)整合 |
是 |
是 |
是 |
否 |
- |
否 |
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生物安全等級 |
BL1 |
BL1 |
BL2 |
BL1 |
BL1 |
BL1 |
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基因裝載能力 |
- |
- |
<4-5k |
- |
- |
- |
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陽性率 |
低 |
高 |
高 |
高 |
高 |
低 |
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周期 |
基因合成 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
2-3周 |
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病毒包裝 |
- |
- |
1周 |
- |
- |
- |
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混合克隆篩選 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
1-2周 |
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單克隆篩選 |
>3 周 |
>3 周 |
>3 周 |
可選 |
可選 |
>3 周 |
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合計 |
> 8-10 周 |
> 8-10 周 |
>9-11周 |
5-7 周 |
5-7 周 |
> 8-10 周 |
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工作負(fù)荷 |
高 |
中 |
中 |
低 |
低 |
高 |
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